GRAM BOYAMA
GRAM BOYAMA
Gram boyama tekniği, mikrobiyolojide sık kullanılan bir boyama yöntemi olup mikroorganizmaların sınıflandırılmasında ve tanımlanmasında kullanılır. Gram boyama ile bakteriler “gram pozitif’ (gram olumlu) ve “gram negatif’ (gram olumsuz)olarak ikiye ayrılır.
Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar gram pozitiftir. Spiral şekilli bakteriler ise gram negatiftir. Gram pozitif bakterilere örnek olarak Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis verilebilir. Gram negatif bakterilere örnek olarak E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Etıterobacter aerogenes verilebilir. Gram boyama için hazırlanacak preparatlarda kullanılacak kültürlerin genç (18-24 saatlik) olması gerekir. Daha yaşlı kültürlerle çalışılması durumunda yanlış sonuçlar alınabilir. Gram (+) bakteriler de gram (-) gibi değerlendirilebilir.
Gram boyama aşamaları ve her aşamada bakterilerin renkleri
Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar gram pozitiftir. Spiral şekilli bakteriler ise gram negatiftir. Gram pozitif bakterilere örnek olarak Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis verilebilir. Gram negatif bakterilere örnek olarak E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Etıterobacter aerogenes verilebilir. Gram boyama için hazırlanacak preparatlarda kullanılacak kültürlerin genç (18-24 saatlik) olması gerekir. Daha yaşlı kültürlerle çalışılması durumunda yanlış sonuçlar alınabilir. Gram (+) bakteriler de gram (-) gibi değerlendirilebilir.
En sık uygulanan gram boyama yönteminde aşağıdaki işlemler sırasıyla uygulanır:
⇒ 1,2’de belirtildiği şekilde preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tespit).
⇒ Preparatın üzerine kristal viyole boya çözeltisi eklenerek kaplanır ve 1 dakika beklenir.
⇒ Preparat bol distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine lugol çözeltisi eklenerek kaplanır ve 1 dakika beklenir.
⇒ Preparat distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine %95’lik etanol veya asit-alkol karışımı eklenerek 10-15 saniye beklenir.
⇒ Preparat distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine sulu fuksin veya safranin boya çözeltisi eklenerek kaplanır ve 30 saniye beklenir.
⇒ Preparat bol distile suyla yıkanır.
⇒ Preparat havada veya kurutma kâğıdı ile kurutulur.
⇒ Mikroskopta incelenir. Mor renkte görülen mikroorganizmalar gram (+), pembe-kırmızı renkte görülenler ise gram (-)olarak değerlendirilir.
Gram (+) ve gram (-) mikroorganizmaların tamamı kristal viyole boyası ile mor renge boyanırlar. Preparata eklenen lugol solüsyonu ile gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa gram (-) bakterilerin oluşturduğu yapı alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon).
Gram (-) bakterilerin renkleri alkolle gittiğinden ortama daha sonra eklenen sulu fuksin ile boyanır. Böylece gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), gram (-) bakteriler pembe-kırmızı renkte (sulu fuksin rengi) boyanır.
⇒ 1,2’de belirtildiği şekilde preparat hazırlanır (yayma, kurutma, tespit).
⇒ Preparatın üzerine kristal viyole boya çözeltisi eklenerek kaplanır ve 1 dakika beklenir.
⇒ Preparat bol distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine lugol çözeltisi eklenerek kaplanır ve 1 dakika beklenir.
⇒ Preparat distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine %95’lik etanol veya asit-alkol karışımı eklenerek 10-15 saniye beklenir.
⇒ Preparat distile suyla yıkanır.
⇒ Preparatın üzerine sulu fuksin veya safranin boya çözeltisi eklenerek kaplanır ve 30 saniye beklenir.
⇒ Preparat bol distile suyla yıkanır.
⇒ Preparat havada veya kurutma kâğıdı ile kurutulur.
⇒ Mikroskopta incelenir. Mor renkte görülen mikroorganizmalar gram (+), pembe-kırmızı renkte görülenler ise gram (-)olarak değerlendirilir.
Gram (+) ve gram (-) mikroorganizmaların tamamı kristal viyole boyası ile mor renge boyanırlar. Preparata eklenen lugol solüsyonu ile gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa gram (-) bakterilerin oluşturduğu yapı alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon).
Gram (-) bakterilerin renkleri alkolle gittiğinden ortama daha sonra eklenen sulu fuksin ile boyanır. Böylece gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), gram (-) bakteriler pembe-kırmızı renkte (sulu fuksin rengi) boyanır.
Gram pozitif ve graın negatif hücre duvarı
Gram boyanma özelliği bakteri hücre duvarının (çeperi) yapısı ile ilgilidir. Hücre duvar yapıları arasındaki farklar:
➨ Gram (+) bakterilerin hücre çeperinde gram (-) bakterilere göre daha kalın peptidoglikan tabakası mevcuttur.
➨ Gram (+) bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram (-) bakterilerin hücre çeperinde lipidler fazladır. Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülünün açığa çıkması) uğrar. Porlar iyice büzüşür, daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitler de ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan porlar daha çok açılarak genişler.
➨ Gram (+) hücre çeperinde teikoik asit olmasına rağmen gram (-) yoktur.
INSTAGRAM
Post a Comment